Austeru sēņu lakāzes NRC 620 ražošana un bioķīmiskā raksturošana, kā arī tās efektivitātes novērtējums ābolu sulas dzidrināšanā.

Pēc 25 dienu statiskas inkubācijas 28°C temperatūrā *Pleurotus ostreatus* NRC620 lakāze uzrādīja visaugstāko aktivitāti sēnīšu kultūras vidē. Optimālās pH un temperatūras vērtības šim enzīmam bija attiecīgi 3,0 un 70°C. Pēc 2 stundu inkubācijas 40°C un 50°C temperatūrā enzīma aktivitāte saglabājās attiecīgi 68,33% un 59,61%. Pēc 2 stundu inkubācijas citrāta-fosfāta buferšķīdumā (pH 7,0) enzīma aktivitāte saglabājās 100%. 10 mM MgSO₄ un CuSO₄ pievienošana palielināja enzīma aktivitāti attiecīgi par aptuveni 21% un 35%, savukārt NaCl, MnCl₂, KCl un CaCl₂ inhibēja enzīma aktivitāti. Izmantojot ABTS kā substrātu, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakāzes kinētiskie parametri (Km un Vmax) bija attiecīgi 1,99 mM un 16 217 μmol min−1 L−1. Ābolu sulas paraugu enzīmu apstrāde ievērojami samazināja gan pH līmeni, gan viskozitāti, un šī samazināšanās korelēja ar uzglabāšanas laika palielināšanos. Lakāzes apstrāde nedaudz samazināja ābolu sulas kopējo fenolu saturu, bet antioksidantu aktivitātes samazināšanās netika novērota.
Pēdējos gados pētnieki ir pievērsušies zaļās biotehnoloģijas pielietojumam pārtikas rūpniecībā. Lakāze ir viens no visnoderīgākajiem fermentiem pārtikas rūpniecībā, kas tiek izmantots tādās jomās kā sulu pārstrāde, cepšana, vīna stabilizēšana un pārtikas produktu organoleptisko īpašību uzlabošana.¹Daudzi augstākie augi un mikroorganismi izdala lakāzi,²un sēnītes, piemēram, deuteromicētes, askomicētes un bazidiomicetes, var ražot arī lakāzi.³Lakāze (EC 1.10.3.2) ir zilā oksidāze, kas reducē molekulāro skābekli līdz ūdenim, izmantojot sistēmu, kas sastāv no trim dažādiem vara atomiem, tādējādi oksidējot dažādus fenola savienojumus un aromātiskos amīnus. Augļu un dārzeņu sulu ražošanas laikā fermentatīva un neenzimātiska brūnināšana ir kritiski svarīgi jautājumi.⁴Tā kā šīs vielas negatīvi ietekmē sulas krāsu, garšu un aromātu, tās ir jānoņem.⁵
No visiem augļiem āboli ir visvairāk patērētie visā pasaulē un Eiropas Savienībā. 2019. gadā ābolu ražošana ieņēma trešo vietu pasaulē, pārsniedzot 87 miljonus tonnu.⁶Āboli satur daudz fenola savienojumu, tostarp flavonoīdus un fenola skābes, piemēram, kofeīnskābi un hlorogēnskābi.⁷Tā kā ābolu sula parasti tiek patērēta dzidrā veidā, filtrēšanas procesā tiek zaudēti aptuveni 50–90 % fenola komponentu.⁸Mūsdienās patērētāji mēdz izvēlēties minimāli apstrādātus produktus, piemēram, duļķainu ābolu sulu ar augstu polifenolu saturu. Tomēr, pateicoties augstajam fenolu saturam, šāda veida ābolu sula ir īpaši uzņēmīga pret krāsas maiņu un tumšošanos.⁹Lai samazinātu vai novērstu ābolu sulas tumšošanos, tiek izmantotas dažādas tehnoloģijas, tostarp termiskās apstrādes metodes, piemēram, pasterizācija 60–90 °C temperatūrā.¹⁰Tomēr saskaņā ar Sauceda-Gálvez pētījumu¹¹Termiskā apstrāde var iznīcināt gaistošās ķīmiskās vielas un ietekmēt ābolu sulas organoleptiskās īpašības. Alternatīvas termiskās apstrādes metodēm ir superkritiskais oglekļa dioksīds, ultravioletais starojums, ultraskaņa, augsts hidrostatiskais spiediens vai augstspiediena homogenizācija.¹²Šo tehnoloģiju efektivitāte un piemērotu augļu sulu raža ir atkarīga no izmantotajiem parametriem un produktu īpašībām. To plašu izmantošanu ierobežo augstās izmaksas, negatīva ietekme uz dažu pārtikas produktu kvalitāti vai nepietiekama enzīmu inaktivācija.^13,14
Lakāzi var izmantot augļu sulas stabilizēšanai un dzidrināšanai.¹⁵Gökmen et al.¹⁶iesaka augļu sulu dzidrināšanai izmantot lakāzi, jo tā efektīvi noņem fenola savienojumus, pārvēršot tos polimēros vai oligomēros, kurus var viegli noņemt ar jebkuru ultrafiltrācijas membrānu, ļaujot ābolu sulai saglabāt stabilu krāsu un dzidrumu līdz pat sešām nedēļām 50°C temperatūrā. Attīrīta *Trichoderma* lakāze tika imobilizēta uz alumīnija oksīda lodītēm un izmantota, lai selektīvi noņemtu nepatīkamas garšas savienojumus, ko izraisa ābolu sulas mikrobiālais piesārņojums.¹⁷
Aptuveni 80–90 % ābolu sulas gaistošo komponentu ir esteri un aldehīdi, kas piešķir sulai unikālu aromātu.¹⁸Ābolu sulas dzidrināšanai uz lēta pamatnes, kas izgatavota no jaunu kokosriekstu čaumalu dabīgās šķiedras, tika imobilizēta *Trametes versicolor* lakāze.¹⁹Iepriekšējos pētījumos ir pētīta ābolu sulas stabilizācija (krāsa un duļķainība), izmantojot bezenzīmu vai imobilizācijas metodes, vai kombinācijā ar ultrafiltrāciju.^5,19Tomēr sēnīšu lakāžu ietekme uz ābolu sulas fizikāli ķīmiskajām īpašībām uzglabāšanas laikā joprojām nav skaidra. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija eksperimentāli izpētīt ābolu sulas fizikāli ķīmisko īpašību, fenola savienojumu satura un antioksidanta aktivitātes izmaiņas pēc apstrādes ar sēnīšu lakāzēm un divu nedēļu uzglabāšanas ledusskapī. Lakāzēm piemīt spēja oksidēt fenola savienojumus, kas padara tās daudzsološas izmantošanai dažādos rūpnieciskos procesos, tostarp sulu dzidrināšanā. Šajā pētījumā tika pētītas lakāzes no *Pleurotus ostreatus* NRC 620, koncentrējoties uz ideālajiem apstākļiem to aktivitātei un efektivitātei sulu dzidrināšanā. Lai gan pētījumi par austeru sēnēm (P. ostreatus NRC 620) joprojām ir ierobežoti, iepriekšējos pētījumos ir pētīti fermenti no dažādiem sēnīšu avotiem, piemēram, Trametes versicolor un Ganoderma lucidum. Šī pētījuma mērķis bija novērtēt šī fermenta potenciālo pielietojumu pārtikas rūpniecībā un izcelt tā unikālās īpašības, jo īpaši tā ideālo pH līmeni un temperatūru.
2,2′-azooksibis(3-etilbenzotiazolīn-6-sulfonskābe) (ABTS) tika iegādāta no Sigma-Aldrich (Kanāda). Visi pārējie reaģenti bija analītiskās kvalitātes.
Nacionālā pētniecības centra Mikrobu kultūru kolekcijas centrs ieguva zināmo austeru sēņu celmu NRC620. Pēc subkultivēšanas šis celms tika uzglabāts uz kartupeļu dekstrozes agara slīpmateriāliem 4°C temperatūrā. Inokula sagatavošanas metode bija šāda: 10 dienas vecs, pilnībā attīstīts micēlijs tika inokulēts uz kartupeļu dekstrozes agara plāksnēm un inkubēts 28°C temperatūrā. Pēc 10 dienām no agara barotnes, izmantojot sterilu metāla perforatoru, tika izņemti trīs 12 mm diametra micēlija bloki un ievietoti 250 ml Erlenmeijera kolbās ar vates aizbāžņiem, kas saturēja 50 ml sterilizētas barotnes (pH 5,0, kā iepriekš aprakstījuši Othman et al.).²⁰). Kultūras tika inkubētas 28°C temperatūrā 18 dienas. Pēc tam kultūras tika filtrētas caur Whatman Nr. 1 filtrpapīru, un iegūtais supernatants kalpoja par enzīmu avotu.
Lakāzes aktivitāte tika noteikta, izmantojot ABTS kā substrātu. Reakcijas maisījums (2 ml) saturēja 500 μL 0,3 mM ABTS (izšķīdināts 0,1 M nātrija citrāta buferšķīdumā, pH 4,5) un nepieciešamo fermenta parauga daudzumu, kas atšķaidīts ar destilētu ūdeni.^21,22Ņemot vērā, ka lakāze var oksidēt ABTS istabas temperatūrā (28 °C ± 2), ABTS oksidācija tika noteikta, mērot absorbcijas pieaugumu pie 420 nm (ε₄₂₀= 36 000 cm3^-1 M ^-1), izmantojot Agilent Carry-100 UV spektrofotometru. Lai oksidētu 1 μmol ABTS minūtē, bija nepieciešama viena lakāzes aktivitātes vienība. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bredforda metodi, izmantojot liellopu seruma albumīnu kā iekšējo kontroli.^23,24
Pēc fermenta iegūšanas no austeru sēņu celma NRC 620, tā aktivitāte tika mērīta dažādos kultivēšanas intervālos 25 dienas statiskos apstākļos 28 °C temperatūrā.
Lai pētītu temperatūras ietekmi uz lakāzes aktivitāti, eksperimenti tika veikti temperatūras diapazonā no 20 līdz 90 °C. Pirms enzīma pievienošanas un reakcijas uzsākšanas buferšķīdums (0,1 M nātrija citrāts, pH 4,5) un substrāts (ABTS) tika sajaukti un inkubēti 5 minūtes dažādās temperatūrās. Enzīma termiskā stabilitāte tika novērtēta, inkubējot 0,05 M nātrija fosfāta buferšķīdumā (pH 7,0) attiecīgi 40, 50, 60 un 70 °C temperatūrā 2 stundas. Atlikušā aktivitāte tika novērtēta, izmantojot ABTS substrātu.
pH ietekme uz lakāzes aktivitāti tika novērtēta, izmantojot ABTS kā substrātu 0,1 M citrāta-fosfāta buferšķīdumos ar pH diapazonu no 2,5 līdz 7,0. Lai novērtētu pH stabilitāti, enzīmu šķīdumu inkubēja divas stundas 40°C temperatūrā 0,1 M citrāta un Tris buferšķīdumos (pH 3, 4, 6 un 7). Atlikušā aktivitāte ar ABTS kā substrātu tika aprēķināta pēc inkubācijas.
Lakāzi 10 minūtes inkubēja nātrija fosfāta buferšķīdumā (0,05 M, pH 7,0), kas saturēja dažādus metālu jonus (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ un Mn2+) attiecīgi 2,5 mM un 10 mM koncentrācijās. Pēc tam pievienoja substrātu (ABTS), lai uzsāktu reakciju, un novērtēja relatīvo aktivitāti.
Lai noteiktu kinētiskos parametrus (Vmax un Km), tika mērīta ABTS oksidēšanās ar lakāzi dažādās koncentrācijās (0,025–3 mM) pie pH 4,5.^konstantesMihaelisa-Mentena vienādojuma vērtības tika aprēķinātas, izmantojot Lineweaver-Burk grafiku, kas attēlo reakcijas ātruma apgriezto vērtību kā substrāta koncentrācijas funkciju. Kinētiskās konstantes tika aprēķinātas no Lineweaver-Burk grafika, izmantojot GraphPad Prism 6.01 programmatūras versiju.
Pēc rūpīgas ābolu mazgāšanas ar krāna ūdeni tie tika pārgriezti uz pusēm un izspiesta sula, izmantojot pilnībā automātisku Braun MP80 ābolu sulu spiedi (ražota Vācijā). Sula tika filtrēta caur četriem marles slāņiem. Kontroles grupai netika pievienoti enzīmi, savukārt svaigi pagatavotai ābolu sulai tika pievienota 2,0% lakāze (visefektīvākā testētā koncentrācija), un pēc tam to divas nedēļas uzglabāja 4°C temperatūrā.
Titrējamais skābums (TA) un pH tika noteikti saskaņā ar Boulton et al. metodi.^27. al.Katra parauga pH tika mērīts, izmantojot digitālo pH metru (JENWAY 3510 pH metrs). Titrējamā skābuma (TA) vērtība tika aprēķināta, pamatojoties uz ābolskābi, izmantojot šādu formulu.
Kur V un C ir attiecīgi titrēšanā izmantotā nātrija hidroksīda šķīduma tilpums (ml) un koncentrācija (0,1 mol/l). K ir ābolskābes konversijas koeficients, kas vienāds ar 0,067, un W ir ābolu sulas masa (g).
Kopējais šķīstošo cietvielu daudzums (^{Nodokļu deklarācija}) visu sulas paraugu saturs tika noteikts, izmantojot PAL-1 kabatas refraktometru (ATAGO, Tokija, Japāna). Pēc katra mērījuma optiskā lēca tika noskalota ar dejonizētu ūdeni, un katrs ābolu sulas paraugs tika pārbaudīts trīs reizes. Katra parauga vērtība tika aprēķināta, aprēķinot trīs mērījumu vidējo vērtību. Arī katra ābolu sulas parauga vidējā vērtība ± standartnovirze tika aprēķināta, aprēķinot šo rezultātu vidējo vērtību.
Ābolu sulas paraugu viskoelastību novērtēja, izmantojot rotācijas viskozimetru (RV, Rheotest 2, Vācija). Paraugs tika ievietots viskozimetra “S2” cilindrā. Šķietamo viskozitāti attēloja bīdes sprieguma un bīdes ātruma līknes slīpums, kas tika aprēķināts no bīdes sprieguma un atbilstošajām līknēm pie dažādiem bīdes ātrumiem (no 1,00 līdz 437,4 s⁻¹). Šķietamās viskozitātes aprēķināšanas formula ir šāda:
Kur η ir šķietamā viskozitāte (cP), τ ir bīdes spriegums (dyn/cm²), γ ir bīdes ātrums (sec⁻¹) un (τ) tiek aprēķināts, izmantojot griezes momenta (α) un cilindra (Z) vērtības, izmantojot šādu formulu: τ = Z . α.
Brūnēšanas indekss tika noteikts pēc Meidav ​​et al. metodes.^al.2910 ml sulas paraugu centrifugēja ar ātrumu 2750 x g 10 minūtes. 5 ml sulas supernatanta sajauca ar 5 ml 95 % etanola. Maisījuma absorbciju mērīja pie 420 nm, izmantojot Shimadzu UV spektrofotometru (UV-1601 PC).
Kopējais fenolu saturs (TPC) tika noteikts kolorimetriski, izmantojot Folin-Ciocalteu reaģentu, kā aprakstījuši Boulton et al.^[27]]. Gallskābes standarta līkne tika konstruēta koncentrācijām no 0 līdz 500 mg/l (^r²= 0,997). Rezultāti ir izteikti kā gallskābes ekvivalenti (mg GAE/ml).
Pie 25 μl ābolu sulas pievieno 125 μl destilēta ūdens un 2850 μl FRAP šķīduma un atstāj maisījumu tumsā uz³⁰min. Pēc tam izmēriet absorbciju pie 593 nm, izmantojot Shimadzu UV spektrofotometru (UV-1601 PC). FRAP reaģentu sagatavoja, sajaucot 300 mM acetāta buferšķīdumu (pH 3,6), 20 mM dzelzs(III) hlorīdu un 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazīnu (TPTZ) (izšķīdinātu 40 mM HCl) attiecībā 10:1:1. Standarta līkne tika ģenerēta, izmantojot Trolox kā standartu (^R²= 0,999), un rezultāti ir izteikti kā μM Trolox/ml.
Apstrādāto un neapstrādāto sulu antioksidanta aktivitāte tika noteikta, izmantojot DPPH metodi, lai novērtētu to spēju piesaistīt DPPH brīvos radikāļus.³¹Desmit mikrolitri sulas tika sajaukti ar 1 ml DPPH šķīduma (100 μM) metanolā. Pēc reakcijas tumsā 30 minūtes maisījuma absorbcija tika mērīta pie 517 nm, izmantojot Shimadzu UV spektrofotometru (UV-1601 PC). Rezultāti tika izteikti kā troloksa ekvivalenti (μM troloksa/ml), pamatojoties uz kalibrēšanas līkni (_^R2= 0,990).
Iegūtie dati parādīja, ka NRC 620 austeru sēnēm maksimālā lakāzes ražošana tika novērota 18. fermentācijas dienas beigās, sasniedzot aktivitāti 1302 U/L. Tas kalpoja par pamatu optimālā kultivēšanas laika noteikšanai lakāzes ražošanai (1. attēls). Lai gan enzīmu ražošana palielinājās, palielinoties kultivēšanas laikam, pieauguma temps nebija tieši proporcionāls kultivēšanas laikam; pēc 21 dienas enzīmu aktivitāte bija palielinājusies tikai par 90 U/L (līdz 1390 U/L). Tāpēc galu galā par optimālo kultivēšanas laiku tika izvēlētas 18 dienas, lai līdzsvarotu produkta ražu ar palielināta kultivēšanas laika ekonomiskajiem ieguvumiem.
Kultivēšanas laika ietekme uz lakāzes ražu Pleurotus ostreatus NRC 620. Trīs (12 mm) sēnīšu micēlija bloki tika inokulēti 50 ml sterilas barotnes un pēc tam kultivēti 28 °C temperatūrā dažādu laiku.
Saskaņā ar citiem pētījumiem, mūsu rezultāti liecina, ka ideālais kultivēšanas periods, lai sasniegtu maksimālo lakāzes sekrēciju ar sēnītēm, visticamāk, būs no 7 līdz 36 dienām.³²Saskaņā ar Ezike et al.³³*Trametes polyzona* WRF03 fermentācijas devītās dienas beigās saražoja vislielāko lakāzes daudzumu ar īpatnējo aktivitāti 1637 U/mg olbaltumvielu. Turklāt Othman et al.³⁴konstatēja, ka *Trichoderma harzianum* S7113 piektajā kultivēšanas dienā izdalīja lielu daudzumu lakāzes. Lakāzes ražošanas ātrums sasniedza maksimālo aktivitāti četrpadsmitajā dienā un pēc tam pakāpeniski samazinājās.³⁴Lai gan enzīmu sekrēcija var notikt arī galvenajā augšanas fāzē, tā parasti sasniedz maksimumu starpfāzē un to izraisa oglekļa vai slāpekļa avota patēriņš.^34,35
Lai gan lakāze no Pleurotus ostreatus NRC 620 uzrādīja augstu aktivitāti plašā temperatūras diapazonā no 50°C līdz 80°C, tuvojoties maksimālajai aktivitātei (69–98%), tās maksimālā aktivitāte tika novērota 70°C temperatūrā (2.a att.). Ārpus šī temperatūras diapazona enzīma aktivitāte samazinājās aptuveni 70°C temperatūrā. Šie rezultāti liecina, ka enzīms ir aktīvs augstās temperatūrās, iespējams, tāpēc, ka augsta temperatūra palielina reakcijas kinētisko enerģiju.
Reakcijas temperatūras (a) un pH (b) ietekme uz lakāzes aktivitāti *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperatūra no 20 līdz 90 °C tika sasniegta, maisījumu iepriekš inkubējot dažādās temperatūrās 5 minūtes pirms enzīma pievienošanas un reakcijas uzsākšanas. pH ietekme uz lakāzes aktivitāti tika novērtēta, izmantojot ABTS kā substrātu šķīdumos, kas satur 0,1 M citrāta-fosfāta buferšķīdumu pH diapazonā no 2,5 līdz 7,0.
Saskaņā ar Eziku un citiem^al.33optimālā temperatūra *Trametes polyzona* WRF03 lakāzei ir 55 °C, kas ir tāda pati kā *Ganoderma lucidum*.^lakāze36un līdzīga optimālajai temperatūrai (50 °C) *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakāze . ^Baldrian38norāda, ka, tāpat kā citām lignīnu noārdošām enzīmu sistēmām, lakāzes ideālais temperatūras diapazons ir no 50 līdz 70 °C.
Rezultāti parādīja, ka enzīmam bija visaugstākā aktivitāte pie pH 3,0, sasniedzot 94% aktivitāti pie pH 3,5. Tomēr tas saglabāja aktivitāti plašā pH diapazonā no 2,5 līdz 7,0 (2.b attēls). Turklāt tas uzrādīja augstāku aktivitāti skābā vidē salīdzinājumā ar neitrālu vai sārmainu vidi. Tā aktivitāte saglabājās vismaz 77% pH diapazonā no 2,5 līdz 4,5, bet sasniedza tikai aptuveni 38% pie pH 7,0. Optimālais pH līmenis lakāzei no *Trametes polyzona* WRF03 bija 4,533, kas ir tāds pats kā pH līmenis lakāzēm no *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 un *Trametes hirsuta* 41. Tomēr, saskaņā ar Čeirina u.c. pētījumu...⁴²optimālais pH līmenis lakāzei no *Polymorpha f. sp.* WR710-1 ir 2,2, savukārt optimālais pH līmenis lakāzei no *Polymorpha f. sp.* IBL-04 ir 5,043. Hidroksīda anjonu (lakāzes inhibitora) saistīšanās ar T2/T3 lakāzes vara atomiem var būt iemesls samazinātai lakāzes aktivitātei neitrālos vai sārmainos pH apstākļos. Tas var traucēt iekšējo elektronu pārnesi no T1 centra uz T2/T3 centru, tādējādi^{ierobežojošs}enzīmu aktivitāte23,44
Inkubējot fermentu dažādās temperatūrās, tika konstatēts, ka gan inkubācijas laiks, gan temperatūra ietekmē fermenta stabilitāti. Jāatzīmē, ka lakāze no *Trametes polyzona* NRC 620 uzrādīja augstāku stabilitāti 40 °C un 50 °C temperatūrā, saglabājot attiecīgi 68,33% un 59,61% no sākotnējās aktivitātes pēc 120 minūtēm (3.a attēls). Turpretī tādos pašos apstākļos (40 °C un 50 °C, 120 minūtes) lakāze no *Trametes polyzona* WRF03 saglabāja attiecīgi 64,38% un 42,92% no savas aktivitātes.³³Turpretī, palielinot inkubācijas laiku un temperatūru, samazinājās *Trametes polyzona* NRC 620 lakāzes stabilitāte; pēc inkubācijas 60 °C un 70 °C temperatūrā 60 minūtes tās aktivitāte samazinājās attiecīgi līdz 39,24 % un 1,72 % (3.a attēls). Saskaņā ar eksperimentālajiem rezultātiem, *Trametes polyzona* WRF03 lakāze uzrādīja augstāku stabilitāti 40 un 50 °C temperatūrā visā termiskās apstrādes procesā.³³Līdzīgi arī Lueangjaroenkit et.^al.37un Čairins u.c.^al.42ziņoja par Trametes polyzona KURNW027 un Trametes polyzona WR710-1 lakāžu stabilitāti attiecīgi 50 °C temperatūrā 1 stundu. Kā noderīgs biokatalizators, ko var izmantot dažādās biotehnoloģiju jomās, lakāzei vajadzētu būt labai stabilitātei un veiktspējai plašā temperatūras diapazonā.
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakāzes termostatiskā stabilitāte (a) un pH stabilitāte (b). Termostatiskā stabilitāte tika novērtēta, inkubējot enzīma šķīdumu 0,05 M nātrija fosfāta buferšķīdumā (pH 7,0) attiecīgi 40, 50, 60 un 70 °C temperatūrā 2 stundas. pH stabilitāte tika novērtēta, inkubējot enzīma šķīdumu 0,1 M citrāta buferšķīdumā un Tris buferšķīdumā (pH 3, 4, 6 un 7) 40 °C temperatūrā 2 stundas. Atlikušā aktivitāte tika aprēķināta, izmantojot ABTS kā substrātu pēc inkubācijas.
Lai noteiktu optimālos apstākļus enzīmu lietošanai un uzglabāšanai, mēs pētījām pH ietekmi uz lakāzes stabilitāti. Pakļaušana dažādām pH vērtībām būtiski ietekmēja olbaltumvielu struktūras stabilitāti, tādējādi ietekmējot enzīma molekulas stabilitāti un aktivitāti. Rezultāti parādīja, ka enzīms bija mazāk stabils skābos apstākļos, savukārt labāku stabilitāti tas uzrādīja augstākās pH vērtībās (neitrālā un sārmainā vidē). Pie pH vērtībām 7,0, 6,0, 4,0 un 3,0 enzīmu aiztures rādītāji pēc 120 minūtēm bija attiecīgi aptuveni 100%, 62,54%, 52,39% un 11,14% (3.b att.). *Strombus multisus* WRF03 lakāze uzrādīja augstāku stabilitāti neitrālās pH vērtībās (5,5–6,5) un zemāku stabilitāti skābās pH vērtībās (zem 4,0). Pēc 120 minūtēm pie pH vērtībām 5,5, 6,0 un 6,5 enzīmu aiztures rādītāji bija attiecīgi aptuveni 82%, 100% un 93%.³³Khairin et al.⁴²atzīmēja, ka Trametes polyzona WR710-1 lakāze bija stabila pH diapazonā no 6,0 līdz 7,0, savukārt Sayed et al.⁴⁵parādīja, ka lakāze bija stabilāka neitrāla pH apstākļos. Tomēr Cerrena unicolor lakāze uzrādīja stabilitāti arī sārmainos apstākļos (pH 9,0).⁴⁶Pētītajām lakāzēm bija augsta stabilitāte plašā pH diapazonā. Tā varētu būt svarīga īpašība rūpnieciskiem lietojumiem.
Tā kā dažiem metālu joniem ir gan stimulējoša, gan inhibējoša iedarbība uz enzīmu aktivitāti, to ietekme uz enzīmu aktivitāti ir jāņem vērā rūpnieciskos pielietojumos. Tas ir ļoti svarīgi, jo metālu joni ir izplatīti vides piesārņotāji, kas var ietekmēt ārpusšūnu enzīmu stabilitāti un sintēzi.⁴⁷Lai izpētītu vairāku metālu jonu ietekmi uz lakāzi no *Pleurotus ostreatus* NRC 620, veicām atbilstošus eksperimentus. Kā parādīts 4. attēlā, atkarībā no izmantotā metāla veida, metālu jonu koncentrācijas palielināšana no 2,5 mM līdz 10 mM negatīvi ietekmēja enzīma funkciju. Piemēram,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺un^Cu²⁺varētu stimulēt un aktivizēt enzīmu aktivitāti, vienlaikus^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺un^K⁺varētu inhibēt enzīma aktivitāti. 10 mM koncentrācijā Cu²⁺ un Mg²⁺ joni bija visspēcīgākie lakāzes aktivitātes aktivatori no *Pleurotus ostreatus* NRC 620, nodrošinot aktivācijas pakāpi attiecīgi aptuveni 34% un 20%. Tomēr 10 mM koncentrācijā Ca²⁺ joni bija visspēcīgākais lakāzes inhibitors, samazinot enzīma aktivitāti par aptuveni 60%.
Metālu jonu ietekme uz Pleurotus ostreatus NRC 620 lakāzes aktivitāti. Lakāzi 10 minūtes inkubēja nātrija fosfāta buferšķīdumā (0,05 M, pH 7,0), kas saturēja dažādus metālu jonus 2,5 mM un 10 mM koncentrācijās. Pēc tam reakciju ierosināja, pievienojot substrātu (ABTS), pēc tam izmērot relatīvo aktivitāti.
Mūsu rezultāti saskan ar citu autoru rezultātiem, kuri atklāja, ka Mg²⁺ un Cu²⁺ pastiprina *Trametes polyzona* WRF03³ aktivitāti. Castaño et al.⁴⁸ atklāja, ka *Xylaria* sp. lakāzi zināmā mērā stimulē vara joni (Cu²⁺). Turklāt Foroutanfar et al.⁴⁹ un Si et al.⁵⁰ veica līdzīgus pētījumus ar lakāzēm attiecīgi no *Paraconiothyrium variabile* un *Trametes pubescens*. Šī enzīma II tipa vara saistīšanās vieta (T2) noteiktā koncentrācijā var būt piesātināta ar Cu²⁺, kas var izskaidrot lakāzes aktivitātes stimulāciju augstākās Cu²⁺³⁹ koncentrācijās. Tā kā baltās puves sēnīšu lakāzes ir oksidāzes, kas satur vairākus vara atomus, vara jonu ietekme uz lakāzes aktivitāti ir dažāda un svārstās no stimulējošas un inhibējošas līdz neitrālai.⁵¹ Turpretī Džou et al.^[52]ziņoja, ka^Cu²⁺nomāca Taivānas pazemes termīta (Odontotermes formosanus) lakāzes aktivitāti. Tomēr Cerena sp. HYB07 lakāzes^[53]un Clitocybe maxima^[54]nebija pakļauti vara jonu ietekmei.
Substrāta specifiskumu attēloja tā kinētiskie parametri (Km un Vmax); jo spēcīgāka ir substrāta saistīšanās afinitāte ar enzīmu, jo zemāka ir Km vērtība un jo augstāka ir substrāta specifiskums.^{3, 21, 55}*Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakāzes kinētiskie parametri (Km un Vmax) tika noteikti, izmantojot GraphPad Prism 6.0 programmatūru, uzzīmējot Lineweaver-Burk grafiku (5. attēls). Izmantojot ABTS kā substrātu, rezultāti bija 1,99 mM un 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}attiecīgi. Elsayed et al.²¹ziņoja, ka ABTS oksidācijas Km vērtības bija attiecīgi 0,1 mM un 0,064 mM, kas norāda uz Lac A un Lac B izoenzīmu augstu afinitāti pret ABTS. Turklāt Vmax vērtības bija 0,182 μmol.^min⁻¹un 0,603 μmol^min⁻¹attiecīgi. Iegūtā Km vērtība bija zemāka nekā Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); turklāt arī to Vmax vērtība (1429 mmol min⁻¹) bija zemāka.^zemāksizmantojot ABTS kā substrātu.33 Līdzīgi, Lentinus squarrosulus MR13 un Trametes sp. AH28-2 lakāzes koncentrāciju Km vērtības bija attiecīgi 0,0714 mM un 0,025 mM, un Vmax vērtības bija 0,0091 mM min−1 un 0,67 mM min−1 mg−1 (attiecībā pret ABTS).^{attiecīgi.56,57}
Tika pētīta ABTS koncentrācijas ietekme uz lakāzes aktivitāti no *Pleurotus ostreatus* NRC 620, un tika uzzīmēts Lineweaver-Burk grafiks, kas attēlo sākotnējā reakcijas ātruma apgriezto vērtību atkarībā no ABTS koncentrācijas. ABTS oksidācijas reakcija ar dažādām lakāzes koncentrācijām (0,025–3,0 mM) tika mērīta pie pH 4,5, lai noteiktu kinētiskos parametrus (Vmax un Km). Mihaelisa-Mentena kinētiskās konstantes tika aprēķinātas, izmantojot Lineweaver-Burk grafiku, kas attēlo reakcijas ātruma apgriezto vērtību atkarībā no substrāta koncentrācijas. Kinētiskās konstantes tika aprēķinātas no Lineweaver-Burk grafika, izmantojot GraphPad Prism 6.01 programmatūru.
Tradicionālie dzidrināšanas enzīmi, piemēram, pektināzes, hidrolizē pektīnvielas, samazinot viskozitāti un duļķainību. Tie efektīvi noārda strukturālos polisaharīdus un bieži tiek izmantoti kombinācijā ar citiem enzīmiem, piemēram, celulāzēm un hemicelulāzēm, lai uzlabotu ražu un dzidrumu. Tomēr pektināzes nav īpaši vērstas uz fenola savienojumiem, kas ir galvenie duļķainības un oksidatīvās brūnināšanas veicinātāji, īpaši sulās, piemēram, ābolu un vīnogu sulā.⁵⁸Turpretī lakāzes katalizē fenola savienojumu oksidēšanos, polimerizējot tos lielākās, nešķīstošās molekulās, kuras var atdalīt ar sedimentāciju vai filtrāciju. Šis mehānisms ne tikai uzlabo dzidrumu, bet arī pagarina sulas uzglabāšanas laiku, samazinot fenola savienojumu izraisītas oksidatīvās brūnināšanas iespējamību. Turklāt uz lakāzes bāzes veidotos dzidrināšanas procesus var veikt maigos apstrādes apstākļos (pH 3,5–5,5, temperatūra 25–40 °C), padarot tos piemērotus delikātām sulām, neapdraudot to uzturvērtību vai organoleptiskās īpašības.⁵⁹Pētījumi liecina, ka apstrāde ar pektināzi var attīrīt sulu 1–2 stundu laikā, savukārt apstrādei ar lakāzi parasti nepieciešams ilgāks reakcijas laiks (3–6 stundas), lai pilnībā reducētu fenola savienojumus. Tomēr šo procesu var optimizēt, imobilizējot fermentu vai apvienojot lakāzi ar mehāniskām attīrīšanas metodēm.⁶⁰Šajā pētījumā neattīrīta ekstrakta enzīmu profilēšana atklāja ievērojamu lakāzes un α-amilāzes aktivitāti, savukārt pektināzes un ksilanāzes aktivitāte bija ārkārtīgi zema, un celulāzes aktivitāte netika konstatēta. Tādēļ duļķainības un fenolu satura samazināšanās galvenokārt bija saistīta ar lakāzes darbību, savukārt viskozitātes izmaiņas varētu būt daļēji saistītas ar amilāzes darbību.
1. tabulā parādīti svaigi spiestas ābolu sulas un ar lakāzi apstrādātu paraugu fizikāli ķīmiskie parametri. Rezultāti parādīja, ka svaigi spiestas ābolu sulas iznākums (71,59 %) bija zemāks nekā ar lakāzi apstrādātiem paraugiem (87,34 %). Šie rezultāti atbilst Pilnika un Oranža atklājumiem.⁶¹, kuri norādīja, ka fermentu izmantošana augļu pārstrādē var palielināt sulas ražu, uzlabot filtrāciju un iegūt augstas kvalitātes, dzidru sulu koncentrēšanai. Sulas ražas palielināšanās galvenokārt ir saistīta ar šķīstošo cukuru satura palielināšanos sulā. Augļu fermentatīvās hidrolīzes laikā mezogleja un pektīns produkta šūnu sieniņās tiek iznīcināti un pārvērsti par šķīstošām vielām, piemēram, neitrāliem cukuriem un skābēm.^62.Ar enzīmiem apstrādātās ābolu sulas pH vērtība bija ievērojami zemāka nekā kontroles grupai (P < 0,05), un abu grupu pH vērtība uzglabāšanas laikā ievērojami palielinājās (1. tabula). Šie rezultāti atbilst Marka u. c. rezultātiem.⁶³, kuri atzīmēja, ka kešju riekstu augļu sulas pH līmenis pēc uzglabāšanas pēc termiskās apstrādes samazinājās. Pektīnu degradācija un galakturonskābes veidošanās pēc apstrādes ar fermentiem var būt atbildīga par pH līmeņa paaugstināšanos uzglabāšanas laikā. Ar fermentiem apstrādāto paraugu pH līmenis uzglabāšanas laikā saglabājās no 4,05 līdz 4,31, savukārt neapstrādātas ābolu sulas pH līmenis svārstījās no 4,12 līdz 4,33.
Gan neapstrādātu, gan ar lakāzi apstrādātu paraugu kopējais skābums (TA) uzrādīja lejupejošu tendenci, palielinoties uzglabāšanas laikam (1. tabula). Skābuma samazināšanās tika attiecināta uz organisko skābju pārvēršanu ogļhidrātos vai fermentatīvām reakcijām, kā arī oksidēšanos sulas uzglabāšanas laikā.⁶⁴Kontroles ābolu sulas un ar enzīmiem apstrādāto paraugu kopējais skābums bija zemāks nekā citām sulām (zemeņu sula 0,9%, plūmju sula 2,2%, kumkvata sula 1,0%, aprikožu sula 2,4%, apelsīnu sula 0,8%), bet līdzīgs citu sulu skābumam (piemēram, bumbieru sula 0,3%).⁶²Šīs atšķirības neapstrādātā svaigi spiestā ābolu sulā var būt saistītas ar dažādiem faktoriem, piemēram, augšanas apstākļiem, ģenētiskajiem faktoriem, brieduma līmeni un apstrādes metodēm.⁶⁵Kontroles un ar lakāzi apstrādātās ābolu sulas kopējā skābuma samazināšanās atbilst Singh et al. sniegtajiem rezultātiem.⁶⁶attiecībā uz Jin Nuo ābolu sulas kopējā skābuma samazināšanos pēc 74 dienu uzglabāšanas. No otras puses, Oshmiansky un Wojdylo⁶⁷pētot tradicionālo dzidrināšanas metožu ietekmi, netika konstatētas būtiskas izmaiņas ābolu sulas skābumā.
1. tabulā sniegtie rezultāti liecina, ka ar lakāzi apstrādātās ābolu sulas kopējā šķīstošo cietvielu (TSS) vērtība bija augstāka nekā neapstrādātajam paraugam. Šie rezultāti atbilst publicētajiem pētījumiem.^{. 68}Turklāt 1. tabulā redzams, ka kontroles ābolu sulas grupas TSS vērtība sākotnējā laika punktā bija 9,58 un uzglabāšanas perioda beigās sasniedza 11,05. Šīs vērtības ir zemākas nekā Hamida u. c. ziņotās svaigas ābolu sulas TSS vērtības.^{. 69}(Attiecīgi 11,2 un 11,80). Ar lakāzi apstrādāto ābolu sulas paraugu TSS vērtība ievērojami palielinājās, sākot no 11,23 un sasniedzot 12,93 pēc divu nedēļu uzglabāšanas 4°C temperatūrā (1. tabula). Līdzīgs TSS pieaugums uzglabāšanas laikā tika novērots arī citrusaugļiem, citroniem un saldajiem apelsīniem. Kopējā šķīstošo cietvielu (TSS) palielināšanās uzglabāšanas laikā var būt saistīta ar polisaharīdu (cietes) hidrolīzi par monosaharīdiem (cukuriem), koncentrācijas palielināšanos sulas dehidratācijas dēļ un pektīna sadalīšanos sulā par šķīstošajām cietvielām. Kopējā šķīstošo cietvielu (TSS) palielināšanās, visticamāk, ir saistīta ar šķīstošo cukuru palielināšanos, kas var veidoties, pektīnam vai celulozei pārveidojoties par šķīstošiem cukuriem attiecīgi ar pektīnu vai celulāzi, vai cietes hidrolīzei par cukuriem, kā ziņo Hamed et al.^69.Lakāzes ietekmi uz ābolu sulas īpašībām var novērot vizuāli, jo ar lakāzi apstrādātai ābolu sulai ir labāka plūstamība un zemāka viskozitāte nekā neapstrādātai sulai. Šis novērojums ir reģistrēts 1. tabulā; ar enzīmu apstrādātā parauga viskozitāte bija 1,87 cP, savukārt kontroles parauga viskozitāte bija 2,95 cP. Šis ievērojamais viskozitātes samazinājums, visticamāk, ir saistīts ar pektīniem līdzīgo vielu augstāku ūdens noturēšanas spēju un kohēzijas tīkla struktūras veidošanos.
Šajā pētījumā lakāzes ietekme uz ābolu sulas brūnināšanas indeksu (BI) tika pētīta, mērot absorbciju pie 420 nm, izmantojot spektrofotometru. Rezultāti ir parādīti 1. tabulā. Uzglabāšanas laikā ābolu sulas paraugu BI gan apstrādātajā, gan neapstrādātajā grupā uzrādīja pakāpenisku pieauguma tendenci. BI atspoguļo brūnināšanas pakāpi un var kalpot kā^svarīgsfermentatīvu un nefermentatīvu brūnināšanas reakciju indikators. Absorbcija uzglabāšanas laikā ievērojami palielinājās (P < 0,05). Uzglabāšanas beigās_A420Ābolu sulas paraugu vērtība kontroles un ar enzīmiem apstrādātajā grupā palielinājās attiecīgi par aptuveni 217% un 121% (1. tabula). Rezultāti liecina, ka apstrāde ar enzīmiem var efektīvi samazināt brūnināšanas pakāpi par aptuveni 56%. Bezerra et al. rezultāti.^[19]] atbilst mūsu rezultātiem; Viņi izmantoja lakāzes-glutaraldehīda-kokosriekstu šķiedru, lai dzidrinātu ābolu sulu, samazinot tās sākotnējo krāsu par 61%.
Lai gan augļu sulās esošajiem polifenoliem ir pozitīva uzturvērtība un terapeitiskā ietekme uz cilvēka organismu, tie var reaģēt arī ar olbaltumvielām, izraisot sulas duļķainību, nogulsnēšanos vai duļķainību, tādējādi mainot produkta garšu un aromātu un samazinot tā uzglabāšanas laiku.⁷¹Šī pētījuma mērķis bija droši samazināt fenola savienojumu saturu ābolu sulā, izmantojot lakāzi no Pleurotus ostreatus NRC 620. 1. tabulā sniegtie rezultāti liecina, ka kopējais fenola savienojumu saturs ar lakāzi apstrādātā ābolu sulā bija ievērojami samazināts pirms uzglabāšanas 4 °C temperatūrā. Turklāt kopējais fenola savienojumu saturs samazinājās arī uzglabāšanas laikā abos pētītajos paraugos (1. tabula). Sandri u. c. pētījums.⁷²parādīja, ka ar enzīmiem apstrādāta ābolu sula var saglabāt savu antioksidanta aktivitāti un fenola savienojumu saturu. Tomēr Lettera et al. pētījuma rezultāti.⁷³liecina, ka apelsīnu sulas apstrāde ar sēnīšu lakāzi var samazināt fenola savienojumu saturu tajā līdz pat 45%.
Ir pierādīts, ka fenola savienojumiem piemīt tādas īpašības kā brīvo radikāļu iznīcināšana, skābekļa reducēšana un dzēšana, ūdeņraža atomu pārnešana un elektronu ziedošana brīvajiem radikāļiem, padarot tos par spēcīgiem antioksidantiem.⁷⁴Tāpēc šajā pētījumā tika izmantotas uz DPPH un FRAP balstītas metodes, lai novērtētu lakāzes ietekmi uz ābolu sulas antioksidantu aktivitāti, kas uzglabāta ledusskapī 14 dienas (2. tabula). Abas metodes uzrādīja antioksidantu aktivitātes palielināšanos uzglabāšanas laikā, kas var būt saistīts ar brīvo fenolu savienojumu daudzuma palielināšanos vai Mailāra reakcijas produktu (MRP) veidošanos, un Mailāra reakcijas produkti, visticamāk, ir antioksidantu aktivitātes palielināšanās cēlonis.⁷⁵Neenzimātiskas brūnināšanas reakcijas (tostarp askorbīnskābes noārdīšanās, Mailāra reakcijas un skābes katalizēta cukuru noārdīšanās) rada brūnus pigmentus (melanoidinus). Askorbīnskābes noārdīšanās starpprodukti un cukuru noārdīšanās produkti (piemēram, karbonil savienojumi) var reaģēt ar aminoskābēm, izmantojot Mailāra reakcijas.⁷⁶Lai gan augļu un dārzeņu brūnināšana uzglabāšanas laikā ir plaši pētīta, mūsu izpratne par šīm reakcijām joprojām ir ierobežota.⁷⁷Salīdzinot ar FRAP metodi, ar lakāzi apstrādātai ābolu sulai, kas noteikta ar DPPH metodi, bija ievērojami zemāka antioksidanta aktivitāte (2. tabula), un visu paraugu antioksidanta aktivitāte ievērojami palielinājās, palielinoties uzglabāšanas laikam. Šajā pētījumā tika izmantotas divas dažādas antioksidanta aktivitātes noteikšanas metodes, jo to principi atšķiras. DPPH metode mēra spēju neitralizēt brīvos radikāļus, savukārt FRAP metode mēra spēju reducēt dzelzs jonus. Tāpēc ieteicams izmantot vairākas antioksidanta aktivitātes noteikšanas metodes, lai labāk izprastu pētāmo paraugu antioksidanta aktivitāti.⁷⁸
Viens no šī pētījuma galvenajiem atklājumiem ir tāds, ka *Pleurotus ostreatus* lakāze NRC 620 uzrāda optimālu aktivitāti 70°C temperatūrā un pH 3,0. Salīdzinot ar citām sēnīšu lakāzēm, ko parasti izmanto sulu dzidrināšanai, piemēram, *Trametes versicolor* un *Ganoderma lucidum* lakāzēm, *P. ostreatus* NRC 620 uzrāda augstāku termisko stabilitāti un skābāku pH. *Trametes versicolor* un *Ganoderma lucidum* lakāzes parasti uzrāda optimālu aktivitāti 50–60°C temperatūrā un pH vērtībās no 3,5 līdz 5,0. Šī atšķirība var veicināt uzlabotu sulu dzidrināšanas efektivitāti, īpaši skābām sulām, kur stabilitāte pie zemākām pH vērtībām ir kritiski svarīga. *P. ostreatus* NRC 620 unikālā īpašība ir tā, ka, salīdzinot ar citām pētītajām sēnīšu lakāzēm, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 uzrāda spēju efektīvi darboties sarežģītākos apstākļos. Tā augstākā optimālā aktivitātes temperatūra liecina par potenciālām priekšrocībām rūpnieciskos pielietojumos, piemēram, ātrāku reakcijas ātrumu un samazinātu mikrobu piesārņojumu. Tā zemais pH līmenis, kas ir labi piemērots daudzu sulu skābajai dabai, varētu būt noderīgs sulu dzidrināšanas procesos. Šie rezultāti attaisno turpmāku izpēti plaša mēroga pielietojumam, padarot *Pleurotus ostreatus* NRC 620 par dzīvotspējīgu alternatīvu tradicionālajiem sēnīšu lakāzes avotiem. Salīdzinot ar iepriekšējiem pētījumiem, mēs atklājām, ka optimālā temperatūra ir 60°C un optimālais pH līmenis ir 3,0. Pēc reakcijas 60°C temperatūrā 80 minūtes *Ganoderma lucidum* lakāze saglabājās⁴⁶% no tās aktivitātes.79 Saskaņā ar Kurniawati un Nicelle datiem⁸⁰*Ganoderma lucidum* enzīmiem ir lieliska līdz vidēja stabilitāte 25°C temperatūrā un pH vērtībās no 5,0 līdz 8,0, kā arī stabilitāte pie pH 6,0 un temperatūrās no 10 līdz 30°C. Šajā pētījumā mēs atklājām, ka optimālais pH un temperatūra enzīmu aktivitātei *Pleurotus ostreatus* bija attiecīgi 3,0 un 70°C. Pēc divu stundu inkubācijas 40°C un 50°C temperatūrā enzīms saglabāja attiecīgi 68,33% un 59,61% no savas aktivitātes. Turklāt Pleurotus ostreatus NRC 620 lakāzei bija augsta aktivitāte plašā temperatūras diapazonā no 50°C līdz 80°C, gandrīz sasniedzot maksimālo aktivitāti (69%–98%), un maksimālā aktivitāte tika novērota 70°C temperatūrā.
Noslēgumā jāsecina, ka statiskos apstākļos iegūtā austeru sēņu lakāze NRC620 uzrādīja optimālu aktivitāti un stabilitāti dažādos pH un temperatūras apstākļos, demonstrējot pārāku stabilitāti salīdzinājumā ar citiem enzīmu avotiem. 10 mM MgSO₄ un CuSO₂ pievienošana palielināja enzīmu aktivitāti attiecīgi par aptuveni 21% un 35%. Pārstrādājot enzīmu ābolu sulā, tas samazināja pH līmeni un viskozitāti, savukārt fenolu saturs uzglabāšanas laikā samazinājās tikai nedaudz.
Rezultāti apstiprina lakāzes potenciālu pārtikas rūpniecībā, jo īpaši dzērienu dzidrināšanā. Specifiski sadalot fenola savienojumus, lakāze ne tikai samazina duļķainību un uzlabo dzidrumu, bet arī saglabā augļu sulu kvalitāti maigos darbības apstākļos. Atšķirībā no tradicionālajiem dzidrināšanas līdzekļiem, piemēram, želatīna, bentonīta un silikagela, lakāze nerada atkritumus un nenoņem patīkamus aromātus no dzērieniem, padarot to par videi draudzīgāku un ilgtspējīgāku variantu. Turklāt, salīdzinot ar citiem enzīmiem un filtrēšanas metodēm, lakāze piedāvā mērķtiecīgu un rentablu risinājumu, neapdraudot produkta kvalitāti.
Kjomuhimbo, HD un Brink, HG. Vara saturošu lakāžu pielietojums un imobilizācijas stratēģijas; apskats. Heliyon 9, e13156 (2023).